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第1篇

學(xué)生做好這一模塊的題目，就需要從四個(gè)方面入手。即如何切入，何為重點(diǎn)，何為難點(diǎn)，如何改進(jìn)。

關(guān)鍵詞：基因工程；復(fù)習(xí)；切入點(diǎn)；重難點(diǎn)；改進(jìn)和調(diào)整

中圖分類號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1992-7711（2016）08-0005

在過去三年的江蘇高考卷中連續(xù)出現(xiàn)了三道基因工程方面的題目，而且分值較高。這就不禁讓筆者有理由推測(cè)明年的高考卷中勢(shì)必還會(huì)出現(xiàn)這種類型的題目，所以筆者在復(fù)習(xí)這一模塊時(shí)，特別總結(jié)了相關(guān)注意事項(xiàng)，并思考如何才能讓學(xué)生理清思路、游刃有余地把這一模塊的題做好。過去三年出的三道題目很類似，都是提供幾種限制酶識(shí)別序列及切割位點(diǎn)圖和轉(zhuǎn)基因操作流程圖，考查的重點(diǎn)問題都是限制酶對(duì)質(zhì)粒和目的基因的識(shí)別與切割，以及切割后的重組問題，即目的基因的獲取和表達(dá)、載體的構(gòu)建。那么，我們的學(xué)生要想做好這種題目，還需要形成哪些方面的認(rèn)識(shí)呢？筆者認(rèn)為在復(fù)習(xí)時(shí)應(yīng)該從以下四個(gè)方面入手：

一、以肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)為復(fù)習(xí)的切入點(diǎn)

復(fù)習(xí)前先帶學(xué)生重新認(rèn)知該實(shí)驗(yàn)的過程，復(fù)習(xí)鞏固生物之間的自然的基因轉(zhuǎn)接過程。從學(xué)習(xí)角度分析，借助學(xué)生所熟知的原型，可以啟發(fā)、引導(dǎo)以實(shí)現(xiàn)溫故而知新。這個(gè)實(shí)驗(yàn)是一個(gè)很好的認(rèn)知原型，讓學(xué)生能夠感悟到大自然的鬼斧神工造就了自然發(fā)生的重組DNA，那我們?nèi)藶榈匾部梢愿淖儯次覀兊幕蚬こ獭；蚬こ痰牟僮鞒绦蛑饕ㄋ膫€(gè)步驟：目的基因的獲取，基因的表達(dá)與載體的構(gòu)建、將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞、目的基因的檢測(cè)與鑒定。其中，獲取目的基因和基因表達(dá)與載體的構(gòu)建是整個(gè)工程的核心技術(shù)。這一技術(shù)涉及許多知識(shí)點(diǎn)，如DNA的結(jié)構(gòu)、DNA的復(fù)制、限制酶和DNA連接酶及DNA作用與特性、基因的表達(dá)、載體的結(jié)構(gòu)組成和作用等。因此，命題者可以從多個(gè)角度考查學(xué)生對(duì)這一系列知識(shí)的整體掌握程度及相關(guān)的能力。前幾年的題目都分別考查了不同的限制酶切割目的基因和質(zhì)粒后可得到重組質(zhì)粒的種類、目的基因?qū)胭|(zhì)粒后對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能的影響、DNA水解酶、毒素蛋白與受體細(xì)胞中受體間的特異性結(jié)合、轉(zhuǎn)基因植物栽培中降低害蟲種群抗性基因頻率增長速率的措施等問題。基因工程內(nèi)容重要，基礎(chǔ)性知識(shí)要求較高，涉及的知識(shí)和技術(shù)多，同一個(gè)問題還可以從不同的角度設(shè)置問題，筆者認(rèn)為，教師在教學(xué)中、學(xué)生在學(xué)習(xí)中仍然要格外重視這部分內(nèi)容。

二、基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容

高中生物選修內(nèi)容包括選修一《生物技術(shù)實(shí)踐》、選修二《生物科學(xué)與社會(huì)》、選修三《現(xiàn)代生物科技專題》。其中，選修三選擇了現(xiàn)代生物技術(shù)中深刻影響著人類社會(huì)的生活、生產(chǎn)和發(fā)展的四大工程：基因工程、細(xì)胞工程、胚胎工程、生態(tài)工程。由于基因工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容，所以顯得尤為重要。因此，我們?cè)诮o學(xué)生復(fù)習(xí)的時(shí)候要特別重視基因工程的復(fù)習(xí)，但在復(fù)習(xí)方法上要側(cè)重理論與原理，注重理解和應(yīng)用，注重與必修內(nèi)容、社會(huì)熱點(diǎn)、生物科技發(fā)展的最新成果的聯(lián)系，注重這些技術(shù)在農(nóng)業(yè)、工業(yè)以及在醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)上的應(yīng)用，努力用已學(xué)的原理和技術(shù)去分析理解并解決其中的一些實(shí)際問題。復(fù)習(xí)的深度不宜過深，在操作技術(shù)上至少要求一般性了解，不宜過細(xì)。另外，微觀的技術(shù)要注意采用模擬操作的方法加強(qiáng)理解，宏觀的技術(shù)要盡可能走進(jìn)工廠或研究所參觀學(xué)習(xí)，加強(qiáng)直觀理解，實(shí)在沒有條件的學(xué)校，要想辦法找一些視頻或錄像反復(fù)地觀看。只有做到理解，才能達(dá)到真正掌握和應(yīng)用。筆者認(rèn)為，學(xué)生之所以一直感到這部分內(nèi)容難，主要原因就在于他們?nèi)狈@一學(xué)習(xí)過程，而是局限于看書和記憶。所以，我們?cè)趶?fù)習(xí)這部分內(nèi)容時(shí)一定要將這個(gè)過程給他們補(bǔ)上。

三、對(duì)雙基的掌握和分析、解決問題的能力是復(fù)習(xí)的重難點(diǎn)

近幾年的生物高考命題指導(dǎo)思想都強(qiáng)調(diào)以能力測(cè)試為指導(dǎo)，重點(diǎn)考查對(duì)基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能的整體掌握程度，力求引導(dǎo)中學(xué)全面實(shí)施素質(zhì)教育。這一指導(dǎo)思想通過近幾年的高考實(shí)踐已經(jīng)得到充分的證明，也就是要求學(xué)生全面掌握《生物課程標(biāo)準(zhǔn)》和考試大綱規(guī)定的基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能。這種整體掌握不但體現(xiàn)在必修和選修上，還體現(xiàn)在要求考生能在相對(duì)簡單的情境中綜合運(yùn)用進(jìn)行分析、判斷、推理和評(píng)價(jià)。這一指導(dǎo)思想表現(xiàn)在試題上為：知識(shí)覆蓋率高，注重基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能，重點(diǎn)內(nèi)容、主干知識(shí)的考查出現(xiàn)頻率高且相對(duì)穩(wěn)定，試題的學(xué)科內(nèi)、專題內(nèi)和專題間綜合性強(qiáng)。那么，像基因工程這么重要的知識(shí)在近三年高考題中連續(xù)出現(xiàn)的現(xiàn)象就不足為奇了。事實(shí)上像遺傳規(guī)律的應(yīng)用、人類遺傳系譜圖的分析、免疫、生態(tài)等內(nèi)容也是連年考，但設(shè)置的問題和考查的角度不完全相同。這一指導(dǎo)思想要求我們學(xué)生既應(yīng)踏踏實(shí)實(shí)地、全面系統(tǒng)地、重點(diǎn)突出地掌握基礎(chǔ)知識(shí)和基本技能，也要能從不同的角度去理解知識(shí)，要能挖掘知識(shí)之間的區(qū)別和聯(lián)系，并在不同的情境中運(yùn)用知識(shí)。

第2篇

筆者根據(jù)課標(biāo)要求，結(jié)合考綱和近年高考考點(diǎn)將近年基因工程考點(diǎn)總結(jié)如下。

一、 基因工程的基礎(chǔ)知識(shí)

基因工程的理論鋪墊――分子生物學(xué)發(fā)展：

① 艾弗里證明了DNA是遺傳物質(zhì)。

② 沃森和克里克證明了DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)。

③ 尼侖貝格破譯了遺傳密碼。

二、 酶切

基因工程選擇限制性內(nèi)切酶作為工具，主要是因?yàn)樗哂斜纫话忝父叩膶Ｒ恍浴Ｓ捎谄渚哂休^高的專一性，因此在基因工程的具體操作中如何選擇限制性內(nèi)切酶是高考的重點(diǎn)考察內(nèi)容。

1. 限制酶的特異性

例1 判斷用限制性核酸內(nèi)切酶切割煙草花葉病毒的核酸是否可行？_____。

答案 不可行

解析 限制酶的專一性非常強(qiáng)，其特異性表現(xiàn)在三個(gè)方面：識(shí)別DNA、識(shí)別特定序列（回文）、切割特定位點(diǎn)磷酸二酯鍵。由于煙草花葉病毒是RNA病毒，所以限制酶不能識(shí)別RNA。

另外要特別注意限制酶切割以后的結(jié)果，磷酸二酯鍵斷裂，暴露出新的磷酸基團(tuán)。

2. 限制酶的選擇

正確選擇限制酶是基因工程中一件非常重要的任務(wù)。限制酶的選擇應(yīng)當(dāng)遵循以下一些原則：不破壞目的基因；不破壞標(biāo)記基因；目的基因和運(yùn)載體上都有限制酶的切割位點(diǎn)。當(dāng)然也要注意用一種限制酶和兩種限制酶切割的區(qū)別。

例2 與只使用EcoR I相比較，使用BamH Ⅰ和Hind Ⅲ兩種限制酶同時(shí)處理質(zhì)粒、外源DNA的優(yōu)點(diǎn)在于可以防止_________

______________________。

答案 質(zhì)粒和含目的基因的外源DN段自身環(huán)化

解析 基因工程中目的基因和質(zhì)粒可以用同一種酶切，也可以用兩種酶切，若用一種酶切，質(zhì)粒只要切一個(gè)切口，目的基因需要切兩個(gè)切口；若用兩種酶切，質(zhì)粒要切兩個(gè)切口，目的基因也需要切兩個(gè)切口。一種酶切出的4個(gè)切口都相同，所以有多種連法，兩種酶切出的質(zhì)粒和目的基因上的4個(gè)切口兩兩相同，因此可以防止自身環(huán)化。

3. 同尾酶

限制酶種類多樣，一些酶之間關(guān)系特殊，如例3中的酶I和酶Ⅱ識(shí)別不同的序列，但能切出相同的黏性末端，它們切出的末端可以連接，被稱為同尾酶。

例3 已知限制酶I的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GGATCC―，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是―GATC―。根據(jù)下圖示判斷下列操作正確的是（ ）

A. 質(zhì)粒用限制酶Ⅰ切割，目的基因用限制酶Ⅱ切割

B. 質(zhì)粒用限制酶Ⅱ切割，目的基因用限制酶Ⅰ切割

C. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅰ切割

D. 目的基因和質(zhì)粒均用限制酶Ⅱ切割

答案 A

三、 連接

1. 連接物類型

經(jīng)過限制酶切割過以后，暴露出的相同的黏性末端可以自動(dòng)連接，考生同時(shí)需要考慮：酶切以后暴露的所有的黏性末端；目的基因兩端的兩個(gè)黏性末端；目的基因所在DNA上其他片段所含的黏性末端；質(zhì)粒上的兩個(gè)黏性末端。綜合以上結(jié)論，連接產(chǎn)物的類型可能就比較多，如目的基因-目的基因連接物、目的基因-運(yùn)載體連接物、運(yùn)載體-運(yùn)載體連接物、其他DN段-運(yùn)載體連接物、目的基因自連、運(yùn)載體自連，若用同一種酶切時(shí)后兩種連接物不存在。

2. 連接酶

下表簡要總結(jié)了基因工程中常見酶的特性差異。

例 PCR反應(yīng)體系中含有熱穩(wěn)定DNA聚合酶，下面的表達(dá)式不能正確反映DNA聚合酶的功能，這是因?yàn)開____________

___________________。

答案 DNA聚合酶只能將單核苷酸連接到雙鏈DN段的引物鏈上

解析 如上表所示，DNA聚合酶的合成需要引物，那么連接酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因?yàn)檫B接酶必須將兩段DNA相連。RNA聚合酶能否催化以上反應(yīng)呢？也不能，因?yàn)镽NA聚合酶雖然不要引物，但其不能催化T參與反應(yīng)，只能利用U。雖然這些酶都是催化磷酸二酯鍵，但它們作用的底物差異較大，所以一定要注意辨析。

以上主要介紹了基因工程的三種操作工具，這些內(nèi)容當(dāng)然是高考的重點(diǎn)和熱點(diǎn)。除此之外有些內(nèi)容也應(yīng)當(dāng)給予一定關(guān)注，如：目的基因的獲取；目的基因的擴(kuò)增（PCR）；土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的目的基因的導(dǎo)入；重組質(zhì)粒的篩選；目的基因的檢測(cè)；轉(zhuǎn)基因生物的安全性；轉(zhuǎn)基因生物的利用等問題。

鞏固訓(xùn)練

1. 目前人類利用基因工程的方法成功培育出轉(zhuǎn)基因抗蟲棉，以下說法正確的是

（ ）

A. 標(biāo)記基因的作用是鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因

B. 抗蟲基因?qū)朊藁ㄈ~肉細(xì)胞后，可通過傳粉、受精的方法，使抗蟲性狀遺傳下去

C. 蘇云金芽孢桿菌的毒蛋白基因與質(zhì)粒結(jié)合后直接進(jìn)入棉花的葉肉細(xì)胞表達(dá)

D. 轉(zhuǎn)基因抗蟲棉經(jīng)過種植，棉鈴蟲不會(huì)產(chǎn)生抗性，這樣可以有效消滅棉鈴蟲

2. 下圖四種質(zhì)粒含有E1和E2兩種限制酶的識(shí)別，Apr表示抗青霉素的抗性基因，Tcr表示抗四環(huán)素的抗性基因。

（1） 將兩端用E1切開的Tcr基因與用E1切開的質(zhì)粒X-1混合連接，連接后獲得的質(zhì)粒類型有______。（可多選）

A. X-1 B. X-2

C. X-3 D. X-4

（2） 若將上圖所示X-1、X-2、X-3、X-4四種質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌，然后分別涂布在含有青霉素或四環(huán)素的兩種培養(yǎng)基上。在這兩種培養(yǎng)上均不能生長的大腸桿菌細(xì)胞類型有____________、____________。

（3） 如果X-1用E1酶切，產(chǎn)生850對(duì)堿基和3 550對(duì)堿基兩種片段：那么質(zhì)粒X-2（Tcr基因的長度為1 200對(duì)堿基）用E2酶切后的片段長度為______對(duì)堿基。

（4） 若將外源的Tcr基因兩端用E2切開，再與用E2切開的X-1混合連接，并導(dǎo)入大腸桿菌細(xì)胞，結(jié)果顯示，含X-4的細(xì)胞數(shù)與含X-1的細(xì)胞數(shù)之比為13，增大DNA連接酶用量能否提高上述比值？______。原因是________

________________________。

3. 下表中列出了幾種限制酶識(shí)別序列及其切割位點(diǎn)，圖1、圖2中箭頭表示相關(guān)限制酶的酶切位點(diǎn)，圖l中Cmlr表示氯霉素抗性基因，Ner表示新霉素抗性基因。請(qǐng)回答下列問題：

（1） 將提取的質(zhì)粒與外源DNA分別加入緩沖液中，選用相應(yīng)的限制酶處理時(shí)，影響處理效果的外界因素主要是______等（寫出兩點(diǎn)）。

（2） 用圖中的質(zhì)粒和外源DNA構(gòu)建重組質(zhì)粒時(shí)，能否使用MspⅠ與BamHⅠ同時(shí)切割質(zhì)粒與外源DNA？答：______，原因是______

___________________________。

（3） 可選用______（兩種）限制酶同時(shí)酶切質(zhì)粒與外源DNA，酶切并連接后可獲得______種含目的基因的重組質(zhì)粒，篩選含有該重組質(zhì)粒的大腸桿菌時(shí)，需要在含______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

（4） 為了從基因文庫中分離獲取T2噬菌體抗性基因，將重組質(zhì)粒導(dǎo)入對(duì)T2噬菌體敏感的大腸桿菌，然后將含有該大腸桿菌的菌液分別接種在預(yù)先涂有______的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，從而初步檢測(cè)目的基因的表達(dá)。

答案

1. A 2. （1） ABC

（2） 無質(zhì)粒細(xì)胞 含X-3的細(xì)胞

（3） 4 750

（4） 不能 DNA連接酶對(duì)DN段沒有選擇性或者DNA末端相同

3. （1） 溫度、pH

（2） 不能 MspⅠ會(huì)切割質(zhì)粒上的兩個(gè)標(biāo)記基因，而BamHⅠ會(huì)切割破壞目的基因

第3篇

關(guān)鍵詞:生物技術(shù);基因工程;細(xì)胞工程

現(xiàn)代生物技術(shù)的迅猛發(fā)展,成就非凡,推動(dòng)著科學(xué)的進(jìn)步,促進(jìn)著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,改變著人類的生活與思維,影響著人類社會(huì)的發(fā)展進(jìn)程。現(xiàn)代生物技術(shù)的成果越來越廣泛地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、能源、化工、輕工和環(huán)境保護(hù)等諸多領(lǐng)域。生物技術(shù)是21世紀(jì)高新技術(shù)革命的核心內(nèi)容,具有巨大的經(jīng)濟(jì)效益及潛在的生產(chǎn)力。專家預(yù)測(cè),到2010～2020年,生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)將逐步成為世界經(jīng)濟(jì)體系的支柱產(chǎn)業(yè)之一。生物技術(shù)是以生命科學(xué)為基礎(chǔ),利用生物機(jī)體、生物系統(tǒng)創(chuàng)造新物種,并與工程原理相結(jié)合加工生產(chǎn)生物制品的綜合性科學(xué)技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)則包括基因工程、蛋白質(zhì)工程、細(xì)胞工程、酶工程和發(fā)酵工程等領(lǐng)域。在我國的食品工業(yè)中,生物技術(shù)工業(yè)化產(chǎn)品占有相當(dāng)大的比重;近年,酒類和新型發(fā)酵產(chǎn)品以及釀造產(chǎn)品的產(chǎn)值占食品工業(yè)總產(chǎn)值的17%。現(xiàn)代生物技術(shù)在食品發(fā)酵領(lǐng)域中有廣闊市場(chǎng)和發(fā)展前景,本文主要闡述現(xiàn)代生物技術(shù)在食品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用。

一、基因工程技術(shù)在食品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用

基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的核心內(nèi)容,采用類似工程設(shè)計(jì)的方法,按照人類的特殊需要將具有遺傳性的目的基因在離體條件下進(jìn)行剪切、組合、拼接,再將人工重組的基因通過載體導(dǎo)入受體細(xì)胞,進(jìn)行無性繁殖,并使目的基因在受體細(xì)胞中高速表達(dá),產(chǎn)生出人類所需要的產(chǎn)品或組建成新的生物類型。

發(fā)酵工業(yè)的關(guān)鍵是優(yōu)良菌株的獲取,除選用常用的誘變、雜交和原生質(zhì)體融合等傳統(tǒng)方法外,還可與基因工程結(jié)合,進(jìn)行改造生產(chǎn)菌種。

(一)改良面包酵母菌的性能

面包酵母是最早采用基因工程改造的食品微生物。將優(yōu)良酶基因轉(zhuǎn)入面包酵母菌中后,其含有的麥芽糖透性酶及麥芽糖的含量比普通面包酵母顯著提高,面包加工中產(chǎn)生二氧化碳?xì)怏w量提高,應(yīng)用改良后的酵母菌種可生產(chǎn)出膨潤松軟的面包。

(二)改良釀酒酵母菌的性能

利用基因工程技術(shù)培育出新的釀酒酵母菌株,用以改進(jìn)傳統(tǒng)的釀酒工藝,并使之多樣化。采用基因工程技術(shù)將大麥中的淀粉酶基因轉(zhuǎn)入啤酒酵母中后,即可直接利用淀粉發(fā)酵,使生產(chǎn)流程縮短,工序簡化,革新啤酒生產(chǎn)工藝。目前,已成功地選育出分解β-葡聚糖和分解糊精的啤酒酵母菌株、嗜殺啤酒酵母菌株,提高生香物質(zhì)含量的啤酒酵母菌株。

(三)改良乳酸菌發(fā)酵劑的性能

乳酸菌是一類能代謝產(chǎn)生乳酸,降低發(fā)酵產(chǎn)品pH值的一類微生物。乳酸菌基因表達(dá)系統(tǒng)分為組成型表達(dá)和受控表達(dá)兩種類型,其中受控表達(dá)系統(tǒng)包括糖誘導(dǎo)系統(tǒng)、Nisin誘導(dǎo)系統(tǒng)、pH誘導(dǎo)系統(tǒng)和噬菌體衍生系統(tǒng)。相對(duì)于乳酸乳球菌和嗜熱鏈球菌而言,德氏乳桿菌的基因研究比較缺乏,但是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒pN42和PJBL2用于構(gòu)建德氏乳桿菌的克隆載體。有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌基因突變有2種方法:第一種方法涉及(同源或異源的)可獨(dú)立復(fù)制的轉(zhuǎn)座子,第二種方法是依賴于克隆的基因組DN斷和染色體上的同源部位的重組整合而獲得。通過基因工程得到的乳酸菌發(fā)酵劑具有優(yōu)良的發(fā)酵性能,產(chǎn)雙乙酰能力、蛋白水解能力、胞外多糖的穩(wěn)定形成能力、抗雜菌和病原菌的能力較強(qiáng)。

二、細(xì)胞工程技術(shù)在食品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用

細(xì)胞工程是生物工程主要組成之一,出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代末至80年代初,是在細(xì)胞水平上改變細(xì)胞的遺傳特性或通過大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以獲得人們所需物質(zhì)的技術(shù)過程。細(xì)胞工程主要有細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合及細(xì)胞代謝物的生產(chǎn)等。細(xì)胞融合是在外力(誘導(dǎo)劑或促融劑)作用下,使兩個(gè)或兩個(gè)以上的異源(種、屬間)細(xì)胞或原生質(zhì)體相互接觸,從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞的現(xiàn)象。細(xì)胞融合技術(shù)是一種改良微生物發(fā)酵菌種的有效方法,主要用于改良微生物菌種特性、提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量、使菌種獲得新的性狀、合成新產(chǎn)物等。與基因工程技術(shù)結(jié)合,使對(duì)遺傳物質(zhì)進(jìn)一步修飾提供了多樣的可能性。例如日本味之素公司應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)使產(chǎn)生氨基酸的短桿菌雜交,獲得比原產(chǎn)量高3倍的賴氨酸產(chǎn)生菌和蘇氨酸高產(chǎn)新菌株。釀酒酵母和糖化酵母的種間雜交,分離子后代中個(gè)別菌株具有糖化和發(fā)酵的雙重能力。日本國稅廳釀造試驗(yàn)所用該技術(shù)獲得了優(yōu)良的高性能謝利酵母來釀制西班牙謝利白葡萄酒獲得了成功。目前,微生物細(xì)胞融合的對(duì)象已擴(kuò)展到酵母、霉菌、細(xì)菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬間,不斷培育出用于各種領(lǐng)域的新菌種。

三、酶工程技術(shù)在食品發(fā)酵生產(chǎn)中的應(yīng)用

酶是活細(xì)胞產(chǎn)生的具有高效催化功能、高度專一性和高度受控性的一類特殊生物催化劑。酶工程是現(xiàn)代生物技術(shù)的一個(gè)重要組成部分,酶工程又稱酶反應(yīng)技術(shù),是在一定的生物反應(yīng)器內(nèi),利用生物酶作為催化劑,使某些物質(zhì)定向轉(zhuǎn)化的工藝技術(shù),包括酶的研制與生產(chǎn),酶和細(xì)胞或細(xì)胞器的固定化技術(shù),酶分子的修飾改造,以及生物傳感器等。酶工程技術(shù)在發(fā)酵生產(chǎn)中主要用于兩個(gè)方面,一是用酶技術(shù)處理發(fā)酵原料,有利于發(fā)酵過程的進(jìn)行。如啤酒釀制過程,主要原料麥芽的質(zhì)量欠佳或大麥、大米等輔助原料使用量較大時(shí),會(huì)造成淀粉酶、俘一葡聚糖酶、纖維素酶的活力不足,使糖化不充分、蛋白質(zhì)降解不足,從而減慢發(fā)酵速度,影響啤酒的風(fēng)味和收率。使用微生物淀粉酶、蛋白酶、一葡聚糖酶等制劑,可補(bǔ)充麥芽中酶活力不足的缺陷,提高麥汁的可發(fā)酵度和麥汁糖化的組分,縮短糖化時(shí)間,減少麥皮中色素、單寧等不良雜質(zhì)在糖化過程中浸出,從而降低麥汁色澤。二是用酶來處理發(fā)酵菌種的代謝產(chǎn)物,縮短發(fā)酵過程,促進(jìn)發(fā)酵風(fēng)味的形成。啤酒中的雙乙酰是影響啤酒風(fēng)味的主要因素,是判斷啤酒成熟的主要指標(biāo)。當(dāng)啤酒中雙乙酰的濃度超過閾值時(shí),就會(huì)產(chǎn)生一種不愉快的餿酸味。雙乙酰是由酵母繁殖時(shí)生成的α-乙酰乳酸和α-乙酰羥基丁酸氧化脫羧而成的,一般在啤酒發(fā)酵后期還原雙乙酰需要約5～10d的時(shí)間。崔進(jìn)梅等報(bào)道,發(fā)酵罐中加入α-乙酰乳酸脫羧酶能催化α-乙酰乳酸直接形成羧基丁酮,可縮短發(fā)酵周期,減少雙乙酰含量。

四、小結(jié)

在食品發(fā)酵生產(chǎn)中應(yīng)用生物技術(shù)可以提高發(fā)酵劑的性能,縮短發(fā)酵周期,豐富發(fā)酵制品的種類。不僅提高了產(chǎn)品檔次和附加值,生產(chǎn)出符合不同消費(fèi)者需要的保健制品,而且在有利于加速食品加工業(yè)的發(fā)展。隨著生化技術(shù)的日益發(fā)展,相信會(huì)開發(fā)出更多物美價(jià)廉的發(fā)酵制品,使生物加工技術(shù)在食品發(fā)酵工業(yè)中的應(yīng)用更加廣泛。

參考文獻(xiàn)

[1]趙志華,岳田利等.現(xiàn)代生物技術(shù)在乳品工業(yè)中的應(yīng)用研究[J].生物技術(shù)通報(bào).2006,04:78-80.

[2]王春榮,王興國等.現(xiàn)代生物技術(shù)與食品工業(yè)[J].山東食品科技.2004,07:31.

[3]徐成勇,郭本恒等.酸奶發(fā)酵劑和乳酸菌生物技術(shù)育種[J].中國生物工程雜志.2004,(7):27.

第4篇

葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細(xì)胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進(jìn)入子代細(xì)胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對(duì)葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。

1葉綠體基因工程概述

1.1葉綠體簡介

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細(xì)胞器,能夠進(jìn)行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個(gè)反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個(gè)大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個(gè)小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。

1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)

葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、便于遺傳的特點(diǎn),故相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞核遺傳更能高效表達(dá)目的基因,這是因?yàn)槿~綠體基因本身擁有巨大的拷貝數(shù)[3]。葉綠體基因可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達(dá)具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對(duì)植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點(diǎn),可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時(shí)間。

1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程

葉綠體轉(zhuǎn)化過程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達(dá)框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細(xì)胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。

1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法

依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對(duì)重組葉綠體進(jìn)行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標(biāo)記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達(dá)。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標(biāo)記基因、同源片斷、啟動(dòng)子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。

2葉綠體基因工程的應(yīng)用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費(fèi)的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點(diǎn)整合試驗(yàn)取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價(jià)值的方法。

2.2合成有機(jī)物質(zhì)

由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點(diǎn),已被越來越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機(jī)物質(zhì)的可靠場(chǎng)所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達(dá)聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細(xì)菌的碳源及能源儲(chǔ)備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達(dá)盒的葉綠體整合及表達(dá)載體,通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點(diǎn)雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。

2.3生產(chǎn)疫苗

人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)效率取決于外源基因的整合位點(diǎn),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外

源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達(dá),且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進(jìn)行表達(dá),為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達(dá)的可行性,他們將基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,分別表達(dá)了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達(dá)量分別為總可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報(bào)道bt表達(dá)量達(dá)46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力。

2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用

葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點(diǎn):一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個(gè)較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價(jià)值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標(biāo)記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。

2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景

當(dāng)今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴(kuò)散,產(chǎn)生超級(jí)雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對(duì)環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核轉(zhuǎn)化作物,因?yàn)榇蠖鄶?shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對(duì)基因污染的憂慮。 　3葉綠體基因工程存在的問題

3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題

由于高等植物的每個(gè)細(xì)胞中有10~100個(gè)葉綠體,每個(gè)葉綠體內(nèi)有10~100個(gè)葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。

3.2植物的種類有待擴(kuò)展

可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點(diǎn)。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實(shí)的植物。

4展望

雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點(diǎn),科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進(jìn)行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進(jìn)葉綠體基因工程,使其優(yōu)點(diǎn)更加明顯,必將在未來生物技術(shù)領(lǐng)域帶來又一場(chǎng)革命,為人類造福。

5參考文獻(xiàn)

[1] 劉良式.植物分子遺傳學(xué)[m].北京:科學(xué)出版社,1997.

[2] boynton j e,gillham n w,harris e h,et al.chloroplast transfo-rmation in chlamydo monas with high veloeity mieroprojeetiles[j].science,1988,240(4858):1534-1538.

[3] 李宏韜,趙淑青,趙彥修,等.葉綠體基因工程簡介[j].遺傳,2003,25(4):495-498.

[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.

[5] 沈桂芳,倪丕沖.植物葉綠體基因工程[j].高科技與產(chǎn)業(yè)化,1999(1):26-28.

第5篇

關(guān)鍵詞植物葉綠體;基因工程;發(fā)展;應(yīng)用;存在問題;展望

葉綠體作為植物中與光合作用直接相連的重要細(xì)胞器,其基因組的功能也因此扮演著十分重要的角色。1882年straburger觀察到藻類葉綠體能分裂并進(jìn)入子代細(xì)胞;1909年baur和correns通過在3種枝條顏色不同的紫茉莉間雜交得出,質(zhì)體是母本遺傳的。人們便開始對(duì)葉綠體遺傳方面產(chǎn)生了濃厚的興趣[1]。1988年boynton等首次用野生型葉綠體dna轉(zhuǎn)化了單細(xì)胞生物衣藻突變體(atpb基因突變體),使其完全恢復(fù)光合作用能力,標(biāo)志著葉綠體基因工程的誕生[2]。葉綠體基因工程作為一種很具有發(fā)展前景的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù),在植物新陳代謝、抗蟲性、抗病性、抗旱性、遺傳育種等方面都將有著越來越重要的意義。

1葉綠體基因工程概述

1.1葉綠體簡介

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的重要器官,是一種半自主型的細(xì)胞器,能夠進(jìn)行自我復(fù)制,含有雙鏈環(huán)狀dna。葉綠體dna分子一般長120~160kb。葉綠體dna有ira和irb 2個(gè)反向重復(fù)序列(分別位于a鏈和b鏈),兩者基因大小完全相同,只是方向相反,它們之間有1個(gè)大的單拷貝區(qū)(大小約80kb)和1個(gè)小的單拷貝區(qū)(大小約20kb)。

1.2葉綠體基因組轉(zhuǎn)化優(yōu)點(diǎn)

葉綠體基因具有分子量小、結(jié)構(gòu)簡單、便于遺傳的特點(diǎn),故相對(duì)于傳統(tǒng)的細(xì)胞核遺傳更能高效表達(dá)目的基因,這是因?yàn)槿~綠體基因本身擁有巨大的拷貝數(shù)[3]。葉綠體基因可實(shí)現(xiàn)外源基因的定點(diǎn)整合,避免位置效應(yīng)和基因沉默;遺傳表達(dá)具有原核性;安全性好,葉綠體屬于母系遺傳,后代材料穩(wěn)定;目的基因產(chǎn)物對(duì)植物的影響小。利用葉綠體基因轉(zhuǎn)化的這些優(yōu)點(diǎn),可以加快育種速度和效率,節(jié)約育種時(shí)間。

1.3葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程

葉綠體轉(zhuǎn)化過程通常分4步:一是轉(zhuǎn)化載體攜帶外源目的基因通過基因槍法或其他轉(zhuǎn)化體系導(dǎo)入葉綠體;二是將外源表達(dá)框架整合到葉綠體的基因組里;三是篩選具有轉(zhuǎn)化的葉綠體細(xì)胞;四是繼代繁殖得到穩(wěn)定的葉綠體轉(zhuǎn)化植物[4]。

1.4葉綠體轉(zhuǎn)化的主要方法

依據(jù)葉綠體轉(zhuǎn)化的主要過程,生物學(xué)家相應(yīng)地研究若干種葉綠體基因轉(zhuǎn)化的方法,其中常用的葉綠體轉(zhuǎn)化方法:一是微彈轟擊法。將鎢粉包裹構(gòu)建完整的質(zhì)粒載體,用基因槍轟擊植物的各種組織、器官,然后對(duì)重組葉綠體進(jìn)行連續(xù)篩選,不斷提高同質(zhì)化水平,最后獲得所需的轉(zhuǎn)基因植株[5]。二是農(nóng)桿菌t-dna介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法。將外源目的基因、選擇標(biāo)記基因等構(gòu)建到農(nóng)桿菌的ti質(zhì)粒上,然后通過與植物組織或器官共培養(yǎng),最后把所需外源基因轉(zhuǎn)化到葉綠體并獲得表達(dá)。三是peg處理法。只需將構(gòu)建好的質(zhì)粒(含外源基因、標(biāo)記基因、同源片斷、啟動(dòng)子、終止子等)在一定的peg濃度下與植物原生質(zhì)體共培養(yǎng)。

2葉綠體基因工程的應(yīng)用

2.1提高植物光合效率

植物的光合效率非常有限,太陽能的很小一部分可以轉(zhuǎn)化為植物所需要的能量,從而轉(zhuǎn)變?yōu)槿祟愋枰漠a(chǎn)品。植物光合效率取決于rubisco酶的豐富度。rubisco酶一方面可以制造可溶性蛋白,另一方面也可以限制co2合成。人們可以通過2種直接的方法提高光合速率:一是加速酶催化的循環(huán)過程;二是提高酶的特性,減少光呼吸浪費(fèi)的能量[6]。很多科學(xué)家正試圖通過提高rubisco酶來提高植物的光合效率,而其中擬南芥和水稻的定點(diǎn)整合試驗(yàn)取得了重大突破,證明葉綠體基因工程是生產(chǎn)高光合效率作物植物的最有價(jià)值的方法。

2.2合成有機(jī)物質(zhì)

由于葉綠體型轉(zhuǎn)基因植物具有環(huán)境安全性好、底物豐富、產(chǎn)物區(qū)域化等優(yōu)點(diǎn),已被越來越多的人關(guān)注,并成為工業(yè)化生產(chǎn)特定有機(jī)物質(zhì)的可靠場(chǎng)所。例如,有科學(xué)家已發(fā)明了用葉綠體基因工程表達(dá)聚3-羥基丁酸酯合成相關(guān)基因的方法。聚3-羥基丁酸酯及其他類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質(zhì),是自然界中多種細(xì)菌的碳源及能源儲(chǔ)備物。具有生物可降解性,如取代化學(xué)合成塑料將能從源頭解決塑料廢棄物引起的“白色污染”。其通過構(gòu)建了含phbb、phm、phbc和aada基因表達(dá)盒的葉綠體整合及表達(dá)載體,通過基因槍轟擊法轉(zhuǎn)化煙草。northem點(diǎn)雜交、rt-pcr分析結(jié)果表明,葉綠體型轉(zhuǎn)基因植株中目的基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)明顯高于核轉(zhuǎn)化植株中相應(yīng)基因。

2.3生產(chǎn)疫苗

人類治療用蛋白質(zhì)可以在葉綠體中實(shí)現(xiàn)表達(dá),表達(dá)效率取決于外源基因的整合位點(diǎn),增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯的調(diào)控元件以及外源蛋白的穩(wěn)定性等。人類已經(jīng)在用葉綠體基因生產(chǎn)疫苗方面開展了卓有成效的工作。例如,范國昌等將甲型肝炎病毒vp3p1區(qū)和丙型肝炎病毒c區(qū)融合,并導(dǎo)入到衣藻葉綠體基因組中,融合蛋白得到高效表達(dá),且具有雙抗原活性。而霍亂病毒蛋白b(ctb)抗原ctb已經(jīng)在葉綠體中轉(zhuǎn)化成功,預(yù)示著轉(zhuǎn)基因植物疫苗的可商業(yè)化前景。tregoning等將tetc基因在煙草葉綠體基因組進(jìn)行表達(dá),為了增加mrna的穩(wěn)定性及在煙草葉片內(nèi)表達(dá)的可行性,他們將基因進(jìn)行了密碼子優(yōu)化,分別表達(dá)了未經(jīng)改造的富含at(72.3%at)和人工合成的富含gc(52.5%at)的基因,tetc-at和tetc-gc的表達(dá)量分別為總可溶蛋白的25%和10%。

2.4在植物抗性方面的研究

在抗蟲性方面,kota和cosa分別于1999年、2001年將btcryzaaz基因轉(zhuǎn)入煙草葉綠體,前者可100%殺死4 000多倍抗性的抗性蟲,后者報(bào)道bt表達(dá)量達(dá)46.1%。在抗逆性方面,人們通過編碼sod、apx等酶的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到煙草、苜蓿、馬鈴薯、棉花的葉綠體中,提高了植物的耐氧化能力,從而提高了植物對(duì)環(huán)境脅迫的耐受能力。

2.5葉綠體基因組在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的應(yīng)用

葉綠體在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的優(yōu)點(diǎn):一是葉綠體基因組是僅次于核基因組的第二大基因組,為比較研究提供了一個(gè)較大的數(shù)據(jù)基礎(chǔ);二是葉綠體dna的核酸置換率適中,在應(yīng)用上很有價(jià)值。然而,用葉綠體dna研究系統(tǒng)發(fā)育也存在著明顯的不足:一是葉綠體基因組是母性遺傳的,因此并不能單靠葉綠體基因組來解釋居群間的雜交現(xiàn)象;二是雖然有越來越多的葉綠體dna被用作分子標(biāo)記來研究類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,但只有將這些分子片段提供的信息與其他的分子片段信息、傳統(tǒng)的形態(tài)及生理特征結(jié)合起來獲得更多的信息,才能更接近系統(tǒng)發(fā)育的本來面目。

2.6葉綠體基因在消除環(huán)境憂慮問題上的前景

當(dāng)今最為普遍的問題就是外源基因從轉(zhuǎn)基因作物到雜草的逃逸,這一逃逸主要是通過花粉的擴(kuò)散,產(chǎn)生超級(jí)雜草或產(chǎn)生和其他作物之間的基因污染,對(duì)環(huán)境極為不利。葉綠體基因工程產(chǎn)生的基因逃逸現(xiàn)象的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于核轉(zhuǎn)化作物,因?yàn)榇蠖鄶?shù)作物中的質(zhì)體dna都是母系遺傳,這樣就可以避免作物和作物、作物和雜草之間的雜交,消除人們對(duì)基因污染的憂慮。

3葉綠體基因工程存在的問題

3.1葉綠體基因轉(zhuǎn)化在雜合體上的穩(wěn)定性問題

由于高等植物的每個(gè)細(xì)胞中有10~100個(gè)葉綠體,每個(gè)葉綠體內(nèi)有10~100個(gè)葉綠體基因組拷貝,因此轉(zhuǎn)化的葉綠體和未轉(zhuǎn)化的野生型葉綠體同時(shí)存在于轉(zhuǎn)基因植株中,造成這種雜合體在遺傳上是不穩(wěn)定的。在轉(zhuǎn)化外源基因之前,目前可采用降低葉綠體拷貝數(shù)、高壓篩選和選用致死突變體作為外源基因的受體等方法使轉(zhuǎn)基因植株易于同質(zhì)化。

3.2植物的種類有待擴(kuò)展

可能是由于大多數(shù)植物的葉綠體基因組序列不清楚,因此無法確定用于載體構(gòu)建的同源重組片段和外源基因的插入位點(diǎn)。目前,已成功轉(zhuǎn)化的植物種類很少,只有番茄和煙草通過有性生殖使外源基因獲得穩(wěn)定遺傳,而番茄卻是唯一能有高的外源蛋白積累的可食用果實(shí)的植物。

4展望

雖然在葉綠體基因工程領(lǐng)域人們已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)于改變?nèi)~綠體基因工程中所存在的缺點(diǎn),科學(xué)界仍然要有大量的工作需要進(jìn)行。為此,尋找更多更加合適的方法來改進(jìn)葉綠體基因工程,使其優(yōu)點(diǎn)更加明顯,必將在未來生物技術(shù)領(lǐng)域帶來又一場(chǎng)革命,為人類造福。

5參考文獻(xiàn)

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[4] svab z,hajdukiewicz p,maliga p.stable transformation of plastids in higher plants[j].proc natlacad sci usa,1990(87):8526-8530.

第6篇

【關(guān)鍵詞】質(zhì)粒載體；標(biāo)記基因；插入失活

質(zhì)粒是基因工程的常用載體，質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和功能也是高考熱點(diǎn)問題之一，2016年全國卷理綜第40題再一次以質(zhì)粒圖譜為基礎(chǔ)，考查了質(zhì)粒作為載體應(yīng)具備的條件，重組質(zhì)粒導(dǎo)入受體細(xì)胞的篩選與鑒定問題，而這一方面的知識(shí)在教材中講解較少，理解起來較抽象，難以透徹的掌握這個(gè)知識(shí)點(diǎn)，給解題帶來困難。本文特針對(duì)質(zhì)粒結(jié)構(gòu)及重組質(zhì)粒篩選與鑒定問題進(jìn)行補(bǔ)充，以期能對(duì)老師教學(xué)和學(xué)生解題帶來幫助。

載體是一種可將外源DN段送入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的運(yùn)載工具。目前已構(gòu)建成的載體主要有質(zhì)粒載體、噬菌體載體、病毒載體和人工染色體等多種類型。其中最常使用的是質(zhì)粒載體。

一、質(zhì)粒載體

質(zhì)粒是一種獨(dú)立于細(xì)菌擬核DNA之外，具有自我復(fù)制能力的小型環(huán)狀DNA分子。由于天然質(zhì)粒作為載體存在著不同的局限性，科研人員對(duì)其進(jìn)行了修飾改造。作為高質(zhì)量的克隆載體的質(zhì)粒必須具有如下特征：1.有復(fù)制原點(diǎn)，這是質(zhì)粒在宿主細(xì)胞內(nèi)能自主復(fù)制的基本條件。2.有多種限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)，以供外源基因的插入。3.有標(biāo)記基因，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性基因，以便從平板中直接篩選陽性重組子。4.相對(duì)分子質(zhì)量較小。5.有安全性，作為克隆載體應(yīng)當(dāng)只存在有限范圍內(nèi)的宿主；在體內(nèi)不進(jìn)行重組；不會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)移；不產(chǎn)生有害性狀；不會(huì)離開宿主而自由擴(kuò)散，因而是相對(duì)安全的。

二、插入失活

將外源DN段插入到載體的標(biāo)記基因中使此基因失活，喪失其原有的表性特征，稱為插入失活。pBR332是研究最多，應(yīng)用最廣泛的質(zhì)粒載體之一，該質(zhì)粒有兩個(gè)標(biāo)記基因， 四環(huán)素抗性基因（Tetr）和氨芐青霉素抗性基因（Ampr），有8種限制酶識(shí)別位點(diǎn)位于Tetr內(nèi)部，另外有2種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)是存在于該基因的啟動(dòng)區(qū)內(nèi)，在這10個(gè)限制位點(diǎn)上插入外源DNA都會(huì)導(dǎo)致Tetr的失活，這時(shí)含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗氨芐青霉素，但對(duì)四環(huán)素敏感。3種限制酶的識(shí)別位點(diǎn)位于Ampr內(nèi)，在這些位點(diǎn)插入外源DNA則會(huì)導(dǎo)致Ampr的失活，這時(shí)含有DNA插入片段的pBR322將使宿主菌抗四環(huán)素，但對(duì)氨芐青霉素敏感。插入失活是檢測(cè)重組質(zhì)粒的一種十分有效的方法。

三、實(shí)例應(yīng)用

2016年全國卷理綜第40題是一道很好的考查質(zhì)粒結(jié)構(gòu)和插入失活效應(yīng)的題目：

某一質(zhì)粒載體如圖所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中會(huì)導(dǎo)致相應(yīng)的基因失活（Ampr表示氨芐青霉素抗性基因，Tetr表示四環(huán)素抗性基因）。有人將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，結(jié)果大腸桿菌有的未被轉(zhuǎn)化，有的被轉(zhuǎn)化。被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌有三種，分別是含有環(huán)狀目的基因、含有質(zhì)粒載體、含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌。回答下列問題：

（1）質(zhì)粒載體作為基因工程的工具，應(yīng)具備的基本條件有______（答出兩點(diǎn)即可），而作為基因表達(dá)載體，除滿足上述基本條件外，還需具有啟動(dòng)子和終止子。

（2）如果用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是______；并且______和_____的細(xì)胞也是不能區(qū)分的，其原因是______。在上述篩選的基礎(chǔ)上，若要篩選含有插入了目的基因的重組質(zhì)粒的大腸桿菌的單菌落，還需使用含有______的固體培養(yǎng)基。

（3）基因工程中，某些噬菌體經(jīng)改造后可以作為載體，其DNA復(fù)制所需的原料來自______。

分析題目可知，本題考查了基因工程質(zhì)粒載體特點(diǎn)、插入失活效應(yīng)在重組質(zhì)粒篩選中的應(yīng)用及噬菌體侵染細(xì)菌后，合成子代噬菌體一切的原料來源于宿主細(xì)胞。分別解析如下：

（1）小題考查了質(zhì)粒作為基因工程的載體應(yīng)具備的基本條件，參考答案：具有復(fù)制原點(diǎn)；具有標(biāo)記基因；具有限制酶的單一識(shí)別位點(diǎn)。

（2）小題考查插入失活及重組質(zhì)粒的篩選問題，將此質(zhì)粒載體用BamHI酶切后，與用BamHI酶切獲得的目的基因混合，加入DNA連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)，用得到的混合物直接轉(zhuǎn)化大腸桿菌，得到的大腸桿菌表型有四種：未被轉(zhuǎn)化大腸桿菌，對(duì)四環(huán)素和氨芐青霉素都敏感，即AmpsTets表型；含有環(huán)裝的目的基因的大腸桿菌，即AmpsTets表型，含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌，即AmprTetr表型；含有插入了目的基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌，即AmprTets。若用含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選，在上述四種大腸桿菌細(xì)胞中，未被轉(zhuǎn)化的大腸桿菌和僅含有環(huán)狀目的基因的細(xì)胞是不能區(qū)分的，其原因是都對(duì)氨芐青霉素敏感，都不能存活，都無菌落產(chǎn)生。含有質(zhì)粒載體的大腸桿菌（AmprTetr）和含有插入了目的基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌（AmprTets）因都能抗氨芐青霉素，都能存活，產(chǎn)生菌落；但因?yàn)槟康幕蛑亟M質(zhì)粒因插入失活破壞了四環(huán)素抗性基因?qū)е滤沫h(huán)素抗性基因失活，因此可用含有四環(huán)素的固體培養(yǎng)基加以篩選。若是在含有氨芐青霉素的培養(yǎng)基上能形成菌落而在含四環(huán)素的固體培養(yǎng)基上不能形成菌落，就是我們所要的含有插入了目的基因重組質(zhì)粒的大腸桿菌。

【參考文獻(xiàn)】

[1]陳閱增普通生物學(xué)/吳相鈺主編.―2版.―北京：高等教育出版社，2005.1

第7篇

關(guān)鍵詞：植物疫苗；基因工程；表達(dá)系統(tǒng)；安全性

1 植物疫苗的免疫原理

植物疫苗可誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)，小腸淋巴組織的粘膜上有一種特殊的細(xì)胞叫做膜細(xì)胞（M 細(xì)胞）。粘膜免疫應(yīng)答就是由M 細(xì)胞識(shí)別抗原開始的。M細(xì)胞識(shí)別抗原并將其傳遞給巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和其它抗原呈遞細(xì)胞，再將抗原展示給輔T細(xì)胞，輔T細(xì)胞識(shí)別外源蛋白質(zhì)片段后就會(huì)刺激B細(xì)胞制造和釋放能中和抗原的抗體，當(dāng)疾病因子出現(xiàn)時(shí)，記憶輔T細(xì)胞刺激胞毒T 細(xì)胞攻擊受感染的細(xì)胞，同時(shí)它迅速刺激記憶B 細(xì)胞分泌中和抗體消滅入侵的病原體。總的來說，轉(zhuǎn)基因植物疫苗可以誘導(dǎo)相應(yīng)的血清型的IgA 和IgG 反應(yīng)。

2 植物疫苗的特點(diǎn)

2.1 安全性高

植物是人類食物來源之一，除個(gè)別人群對(duì)某些特定的植物過敏外，其安全性高。用動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)疫苗，可能有動(dòng)物病毒的污染，對(duì)人類存在潛在危害。而植物病毒不會(huì)感染人類，比較安全，同時(shí)也可避免微生物生產(chǎn)疫苗帶來的有害產(chǎn)物。

2.2 成本低

植物種植系統(tǒng)簡單易行，植物細(xì)胞培養(yǎng)條件簡單，便于進(jìn)行遺傳操作，可通過大面積栽培獲得廉價(jià)的疫苗，且不需要技術(shù)、設(shè)備和種植條件等巨大投資。農(nóng)作物可以當(dāng)?shù)厣a(chǎn)，還易于儲(chǔ)藏和運(yùn)輸，而且經(jīng)過長期種植，植物栽培、收獲、貯藏、加工程序已經(jīng)形成工業(yè)化。與植物生物反應(yīng)器相比，原核生物反應(yīng)器與動(dòng)物生物反應(yīng)器生產(chǎn)時(shí)需要昂貴的技術(shù)設(shè)備、大量的人力物力。

2.3 植物具有完整的真核表達(dá)系統(tǒng)

具有與動(dòng)物相同的真核加工修飾系統(tǒng)。可以對(duì)重組蛋白進(jìn)行糖基化、磷酸化、酰胺化、亞基正確裝配等。微生物系統(tǒng)不能對(duì)真核生物蛋白進(jìn)行正確的翻譯后加工。

2.4 轉(zhuǎn)基因植物中的外源基因可重組

通過植物雜交的方法進(jìn)行基因重組，進(jìn)而在植物體內(nèi)積累多種病原體的抗原基因，生產(chǎn)出方便高效的多聯(lián)疫苗。

3 植物基因工程疫苗外源基因的表達(dá)系統(tǒng)

3.1 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)

主要采用植物病毒作為載體，而外源基因插入到病毒基因組中，通過病毒感染植株，從而將外源基因?qū)胫参锛?xì)胞內(nèi)，采用這種轉(zhuǎn)化方式，外源基因并不整合至植物基因組中，只是利用寄主細(xì)胞在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行復(fù)制，以高拷貝的形式游離于植物中，并進(jìn)行高效的表達(dá)，因此可在短時(shí)間內(nèi)在植物細(xì)胞內(nèi)積累大量的外源蛋白。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，外源基因蛋白的產(chǎn)量一般要低于細(xì)胞內(nèi)可溶性蛋白總量的1%；而采用這種瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),外源基因蛋白總量會(huì)遠(yuǎn)大于1%。

3.2 穩(wěn)定整合系統(tǒng)

3.2.1 土壤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化。目前根癌農(nóng)桿菌主要用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化植物的機(jī)制已從分子水平上基本得到解釋。而發(fā)根農(nóng)桿菌，由于對(duì)Ri 質(zhì)粒了解得還不充分，所以對(duì)這種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的研究主要集中在以生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物為目的的根組織培養(yǎng)和根的發(fā)育。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)化最常采用共培養(yǎng)法，即使用農(nóng)桿菌菌液與葉盤、愈傷組織、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、莖段、下胚軸段、子葉切片等部分進(jìn)行共培養(yǎng)，從而達(dá)到轉(zhuǎn)化的目的。

3.2.2 外源DNA 直接導(dǎo)入法。主要包括基因槍法、電激發(fā)、PEG誘導(dǎo)法、激光穿孔法、脂質(zhì)體法、超聲波法，其中最常用的是基因槍法。它是將帶有外源基因的質(zhì)粒用亞精胺包裹為直徑1μm 左右的金彈或鎢彈，再用高壓氦氣、火藥爆炸力、高壓放電氣體作為動(dòng)力加速子彈，使它們穿過植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，將外源基因帶入具有再生能力的植物組織，這樣可以在很大程度上縮短再生的時(shí)間，從而避免體細(xì)胞變異的發(fā)生。

4 以植物為載體的免疫技術(shù)

4.1 植物疫苗免疫原性和免疫保護(hù)作用

由于植物疫苗一般是通過食用來被人體利用。所以如何避免消化酶的影響來保護(hù)抗原就是一個(gè)重要的研究課題。目前，避免消化酶的影響來保護(hù)抗原可分為2類方法：①用沙門氏菌和弧狀霍亂桿菌作為載體；②用保護(hù)性的包被對(duì)抗原進(jìn)行包裝。

用減毒的菌株可以把抗原引向粘膜的表面，有利于粘膜免疫系統(tǒng)攝取所表達(dá)的抗原。但是基于減毒菌株的方法具有潛在安全缺陷，而后者可通過生物降解的多聚物、脂質(zhì)體、蛋白質(zhì)體或者表達(dá)抗原的轉(zhuǎn)基因植物來實(shí)現(xiàn)。許多研究表明，植物材料可潛在地保護(hù)所選定的抗原。特別在種子中，植物可為亞單位疫苗提供一個(gè)富含蛋白酶抑制物的糖類聚合物基質(zhì)環(huán)境。其它的抗原包裝方法需要煩瑣的處理步驟；而通過植物種子來進(jìn)行生物包裝不需要任何額外的代價(jià)，就可以為這些抗原提供保護(hù)。在有關(guān)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的研究中，從輪狀病毒和產(chǎn)腸毒素大腸桿菌中所選的抗原分別與霍亂毒素的B和A2亞單位融合，抗原的免疫反應(yīng)顯示出對(duì)Th1的偏愛性，并可誘導(dǎo)白細(xì)胞介素2和干擾素γ，CD4 + 水平也相應(yīng)增加。Th1的偏愛性很可能是抗原或者載體的選擇結(jié)果。在佐劑的幫助下，亞單位疫苗的釋放能增加免疫反應(yīng)量。霍亂毒素和大腸桿菌的熱不穩(wěn)定毒素，它們與抗原共表達(dá)，有利于誘導(dǎo)保護(hù)性的免疫產(chǎn)生，改變口服免疫低效率遞呈。另外，有人證實(shí)了轉(zhuǎn)基因植物疫苗的粘膜傳輸中所誘發(fā)的免疫應(yīng)答所具有的黏膜佐劑的特征，這給口服免疫可不需佐劑提供了依據(jù)，同時(shí)也提高了其安全性。

在以植物疫苗的口服免疫研究中，所候選的亞單位疫苗也具有較好的保護(hù)作用。馬鈴薯塊莖或谷物種子中表達(dá)的熱不穩(wěn)定毒素的B 亞基和馬鈴薯中表達(dá)的霍亂毒素B 亞基用于小鼠口服免疫，可以保護(hù)老鼠免受痢疾的感染。另外，口服免疫由谷物種子表達(dá)的傳播性腸炎病毒的S2糖蛋白，對(duì)乳豬能夠起到很好的保護(hù)作用。目前，通過植物遞送系統(tǒng)來生產(chǎn)B 型肝炎的疫苗也逐漸成熟。

4.2 提高抗原在植物中的表達(dá)水平

利用植物進(jìn)行疫苗開發(fā)，首要的問題是，植物能否表達(dá)相關(guān)的蛋白？目前為止，許多亞單位候選抗原在轉(zhuǎn)基因植物中成功表達(dá)，這些抗原主要包括感染人類、家畜、野生動(dòng)物的細(xì)菌和病毒抗原。表達(dá)水平很大程度上取決于表達(dá)的蛋白和用于表達(dá)的植物種類，同時(shí)，構(gòu)建的表達(dá)系統(tǒng)也影響抗原的表達(dá)水平，比如用于表達(dá)的細(xì)胞器基因組(核和質(zhì)粒)、啟動(dòng)子的強(qiáng)度和組織專一性、非翻譯前導(dǎo)序列和信號(hào)序列的選擇和表達(dá)蛋白的靶細(xì)胞器的定位等均對(duì)表達(dá)產(chǎn)生影響。一般而言，利用上述策略可以實(shí)現(xiàn)抗原高水平表達(dá)。然而，很難對(duì)表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行比較，因?yàn)樘囟乖瓕?duì)植物表達(dá)系統(tǒng)的選擇很重要，在不同的系統(tǒng)中其表達(dá)效果是不一樣的。近來，研究人員利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)可提高外源基因的表達(dá)量，Mason等利用一個(gè)核表達(dá)系統(tǒng)，把蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)之后，熱不穩(wěn)定毒素B亞單位在馬玲薯塊莖中表達(dá)量可達(dá)總可溶性蛋白質(zhì)的0.2% ；在谷物種子中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%或12% ，這些都依賴于所用的調(diào)節(jié)序列。另外，霍亂毒素（B）亞單位在利用內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)時(shí)在煙草葉片中的表達(dá)量約占總可溶蛋白的4%。膜蛋白比可溶性蛋白更難于在轉(zhuǎn)基因植物中表達(dá)，大量研究表明，膜蛋白在植物中的表達(dá)量遠(yuǎn)不及可溶性蛋白，這就需要優(yōu)化表達(dá)系統(tǒng)以提高表達(dá)水平。

目前，轉(zhuǎn)基因馬玲薯表達(dá)B型肝炎的表面抗原水平已由馬玲薯大約1mg/g增加到馬玲薯大約16mg/g抗原，這樣可以大大減少口服劑量。目前許多研究表明，所欲表達(dá)的抗原在植物中能夠表達(dá)并裝配成四級(jí)結(jié)構(gòu)。糖基化修飾的蛋白也可在植物中進(jìn)行糖基化，盡管糖基化模式很可能存在著差別。在植物系統(tǒng)中表達(dá)的熱不穩(wěn)定蛋白毒素的B亞單位和霍亂毒素的B亞單位，均有GM1受體結(jié)合活性，B型肝炎表面抗原和諾沃克病毒衣殼蛋白可形成類病毒顆粒，類病毒顆粒的形成，可認(rèn)為有利于誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。

5 植物基因工程疫苗研究進(jìn)展

5.1 反轉(zhuǎn)錄病毒載體

反轉(zhuǎn)錄病毒作為載體是在進(jìn)行動(dòng)物基因工程中發(fā)現(xiàn)的，許多研究人員認(rèn)為它同樣適于植物基因工程，但目前研究的不多。

5.2 單鏈RNA植物病毒

單鏈RNA 植物病毒，即病毒RNA可直接作為mRNA的植物病毒，主要包括苜蓿花葉病毒(ALMV)、豇豆花葉病毒(CPMV)、雀麥花葉病毒(BMV)、煙草花葉病毒(TMV)等。它們作為外源基因載體主要通過以下步驟感染植物：病毒RNA 首先反轉(zhuǎn)錄為一條單鏈cDNA，在DNA聚合酶作用下形成雙鏈DNA，將其克隆入細(xì)菌質(zhì)粒中，將外源基因插入質(zhì)粒的cDNA中，最后通過體外轉(zhuǎn)錄，用帶有外源基因的RNA病毒感染植物，將其轉(zhuǎn)入植物細(xì)胞。

5.3單鏈DNA植物病毒載體

在單鏈DNA 植物病毒載體中，研究最多的是Geminiviruses(簡稱GeNV) ，又叫做雙粒病毒或雙聯(lián)體病毒。它一般含有2個(gè)成對(duì)并存的病毒顆粒，大小約為18～20nm，遺傳物質(zhì)是單鏈DNA ,每2個(gè)顆粒中包含1～2個(gè)、2. 5～3.0 kb的環(huán)狀DNA分子。該病毒寄主廣泛，單子葉植物和雙子葉植物均可被感染，但感染部位僅限于植物的維管組織，且其傳播媒介主要是昆蟲，不能通過機(jī)械接種。

5.4 雙鏈DNA植物病毒載體

雙鏈DNA植物病毒載體中最典型的是花椰菜花葉病毒，它的基因組長約8kb，主要感染花椰菜、油菜、擬南芥等，主要寄主是蕓苔屬植物，目前尚未發(fā)現(xiàn)可感染豆科和單子葉植物。

6 植物疫苗的安全性

6.1 對(duì)環(huán)境的影響

由于在植物疫苗中包含了病原體的DN段，因而花粉和種子的散播造成的基因逃逸可能給人類帶來新的病原、毒素、過敏原等，因此對(duì)可能引起的基因漸滲現(xiàn)象必須做出充分的安全性評(píng)價(jià),并規(guī)范植物疫苗的利用和管理，同時(shí)尋求技術(shù)方法。如可恢復(fù)阻塞(RBF)技術(shù)，它能使自然界中因漸滲而攜帶RBF 的雜種或近緣系植物死亡或不育或利用葉綠體轉(zhuǎn)化植物疫苗或培育植物疫苗的雄性不育系，這樣就可避免花粉傳播而帶來的潛在威脅，轉(zhuǎn)基因植物疫苗有著傳統(tǒng)疫苗無法比擬的優(yōu)越性，已經(jīng)成為一個(gè)研究熱點(diǎn)了。未來的研究應(yīng)著眼于生產(chǎn)出作為醫(yī)藥商品的安全、可靠、有效的植物疫苗。轉(zhuǎn)基因植物疫苗應(yīng)用最大的限制就是表達(dá)量低。現(xiàn)在的研究表明：可以通過葉綠體轉(zhuǎn)化、植物育種和利用食品加工技術(shù)來提高表達(dá)水平，而且研究還指出，運(yùn)用攜帶蛋白和輔助蛋白可以增加抗原被免疫系統(tǒng)識(shí)別的能力。這些研究都使我們?cè)絹碓浇咏a(chǎn)出廉價(jià)“安全口服的商品植物疫苗”，這樣的疫苗將可以幫助人們預(yù)防疾病的傳播。

6.2對(duì)人類和動(dòng)物的影響

抗生素抗性基因是篩選轉(zhuǎn)基因植物常用的標(biāo)記基因。長期食用這類轉(zhuǎn)基因疫苗是否會(huì)對(duì)人體或動(dòng)物造成抗生素醫(yī)療無效。轉(zhuǎn)基因植物中的新基因會(huì)不會(huì)傳遞給人畜腸道的正常微生物，引起菌群和數(shù)量的變化或插入并表達(dá)，從而危害人畜健康？這些問題目前都無法解答，仍需大量學(xué)者繼續(xù)研究論證。

7 展望

利用植物來表達(dá)和遞送疫苗技術(shù)的發(fā)展給免疫研究注入了新的內(nèi)容。以往的研究中,在植物中表達(dá)了包括過濾性病毒、細(xì)菌、腸道和非腸道的病原體等各種不同的抗原，并做了相應(yīng)免疫學(xué)研究。但植物疫苗面臨的最大問題是抗原蛋白在植物細(xì)胞表達(dá)量不高，低劑量抗原蛋白往往不能激發(fā)足夠的免疫反應(yīng)，這不能僅靠增加植物組織攝取量得以解決，因?yàn)榈蛣┝康闹貜?fù)免疫可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體的免疫耐受，導(dǎo)致機(jī)體對(duì)此抗原免疫反應(yīng)保持“低調(diào)”，即使以后增加抗原蛋白的劑量也不能改變。另外，機(jī)體每天對(duì)植物組織的攝取量是一定的，不可能無限增加。因此，未來研究的重點(diǎn)之一是提高植物疫苗中抗原蛋白的表達(dá)量。隨著生物技術(shù)的發(fā)展和植物基因工程研究的深入，基于植物的疫苗遞送系統(tǒng)將更具吸引力，并呈現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

參考文獻(xiàn)

1 余祖華，王紅寧.用植物生物反應(yīng)器研制基因工程疫苗的進(jìn)展[J].生

物技術(shù)，2004（8）

第8篇

一、種類

根據(jù)抗原性質(zhì)可分為滅活疫苗、弱毒活疫苗、亞單位疫苗、工程疫苗、核酸疫苗和轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗；根據(jù)疫苗功效則可分為預(yù)防性疫苗和治療性疫苗。

1. 滅活疫苗。將分類離培養(yǎng)的病原微生物（多數(shù)為強(qiáng)毒株）用適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)試劑將其滅活但保留其免疫原性，與不同的佐劑混合后乳化制成滅活疫苗。目前，用于制備滅活疫苗的佐劑有礦物油佐劑和氫氧化鋁佐劑。前者多用于病毒性疫苗，如當(dāng)前使用的豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、偽狂犬病毒滅活疫苗；用氫氧化鋁作為佐劑制備疫苗靜置后，會(huì)出現(xiàn)分層，疫苗在使用前搖勻即可，該佐劑多用于細(xì)菌疫苗。蜂膠佐劑多用于細(xì)菌苗和亞單位疫苗。

滅活疫苗的用途：①新分離的病原，短期內(nèi)難以致弱。如高致病性豬藍(lán)耳病滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗和兔瘟滅活疫苗。②血清型較多的病原，疫苗的保護(hù)力呈現(xiàn)血清型特異性，如豬胸膜肺炎放線桿菌（15 個(gè)血清型）、副豬嗜血桿菌（15 個(gè)血清型）、豬鏈球菌（35 個(gè)血清型）等。③變異頻率高的病原，如新分離的口蹄疫M(jìn)ya-98 株。

豬用滅活疫苗中，有豬偽狂犬病滅活疫苗、豬口蹄疫0 型（單價(jià)/ 二價(jià)/ 三價(jià)）滅活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒滅活疫苗、豬細(xì)小病毒滅活疫苗、豬乙腦滅活疫苗、豬鏈球菌病單價(jià)( 二價(jià)/ 三價(jià)) 滅活疫苗、副豬嗜血桿菌三價(jià)滅活疫苗和豬傳染性胸膜肺炎三價(jià)滅活疫苗等。

滅活疫苗的優(yōu)點(diǎn)是安全性強(qiáng)，疫苗毒株無毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)；多數(shù)疫苗的免疫接種效果不受仔豬母源抗體水平高低的干擾；貯存條件方面，一般需冷藏保存，不能冷凍。其缺點(diǎn)是需要免疫次數(shù)多，接種后局部反應(yīng)略大，甚至出現(xiàn)接種部位污染，可引起局部炎癥膿腫，影響接種效果，也降低局部的肉品質(zhì)量。

2．弱毒活疫苗。

疫苗種類指將毒力下降或毒力完全喪失的病原微生物，與牛奶、明膠等佐劑混合后經(jīng)過低溫凍干后形成的疏松狀制劑。嚴(yán)格意義上，此類疫苗不包含采用基因工程方法對(duì)基因組改變后引起致病性改變的微生物制備的弱毒疫苗。根據(jù)所含的疫苗毒株分類不同，可以分為以下幾種：（1）細(xì)菌活疫苗：如仔豬副傷寒疫苗，豬丹毒- 肺疫活疫苗。（2）病毒活疫苗：豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗和豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗。（3）豬支原體肺炎活疫苗。預(yù)防豬寄生蟲的活疫苗尚未問世。

我國常用的弱毒活疫苗較多，如豬瘟活疫苗、豬偽狂犬病活疫苗、豬繁殖與呼吸綜合征活疫苗、豬乙肝疫苗、豬丹毒活疫苗、豬肺疫活疫苗、仔豬副傷寒疫苗、豬馬腺疫鏈球菌活疫苗等。

活疫苗的優(yōu)點(diǎn)與缺點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)是：（1）免疫途徑多樣：可通過肌肉注射、滴鼻、口服等途徑免疫。（2）刺激產(chǎn)生黏膜免疫：除肌肉注射外，滴鼻和口服途徑免疫后可刺激機(jī)體產(chǎn)生局部分泌型IgA, 形成黏膜免疫，在預(yù)防呼吸道感染和消化道感染中具有獨(dú)特的作用，這是滅活疫苗無法比擬的，如沙門氏菌口服可以刺激機(jī)體腸道局部黏膜免疫。（3）免疫后可剌激產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，免疫效果較為確實(shí)。（4）免疫次數(shù)少于滅活疫苗。（5）接種后局部反應(yīng)低。缺點(diǎn)：受母源抗體的影響如豬瘟活疫苗、偽狂犬病活疫苗等；受抗菌藥物的影響如仔豬副傷寒弱毒疫苗、豬丹毒- 肺疫二聯(lián)弱毒疫苗和豬支原體弱毒疫苗等；活疫苗運(yùn)輸保存條件嚴(yán)格，需冷凍條件。

3. 基因工程疫苗。

利用分子生物學(xué)手段改造病原微生物的基因，獲得毒力下降、喪失的突變株或構(gòu)建以弱毒株為載體、表達(dá)外源基因的重組毒（菌）株，并利用它們作為疫苗毒株制備疫苗，包括基因缺失活疫苗和基因工程活載體疫苗。該疫苗與常規(guī)弱毒疫苗相比，主要區(qū)別在于后者采用常規(guī)技術(shù)，而非分子生物學(xué)技術(shù)，來致弱病原微生物，不確定其毒力致弱的分子機(jī)制。

作為基因工程疫苗載體的病毒或細(xì)菌，其主要特性是：致病力下降或缺失、對(duì)靶動(dòng)物和非靶動(dòng)物是安全的，基因組龐大、可容納外源基因，并高效表達(dá)。常用的活載體有：偽狂犬病毒弱毒株、腺病毒、沙門氏菌弱毒菌株、乳酸桿菌、胸膜肺炎放線桿菌弱毒株。我國在“十一五”期間，在“863”課題資助下，開展了以偽狂犬病毒為載體，表達(dá)豬細(xì)小病毒、乙腦病毒、口蹄疫病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒主要免疫原性基因的研究。鑒于對(duì)其安全性的憂慮，我國規(guī)定轉(zhuǎn)基因生物（包含基因工程 疫苗）必須經(jīng)歷實(shí)驗(yàn)室和野外安全性觀察測(cè)試，獲得安全證書后，方能進(jìn)行疫苗學(xué)研宄，以申報(bào)獸用生物制品新獸藥證書。目前，我國己經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程疫苗有：豬偽狂犬病基因缺失疫苗、口蹄疫基因工程疫苗、豬大腸桿菌K88-K99 基因工程疫苗。重組載體疫苗尚未正式上市。

4．核酸疫苗。

核酸疫苗產(chǎn)生于20 世紀(jì)80 年代。將病原微生物或寄生蟲基因組中編碼免疫原性蛋白的基因克隆到真核表達(dá)載體中制備重組質(zhì)粒，這種質(zhì)粒直接導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)，利用宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)，合成該蛋白，剌激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)相應(yīng)的細(xì)胞免疫和體液抗體，因而稱之為DNA 疫苗。DNA 疫苗可以用大腸桿菌大量制備，成本較低。針對(duì)細(xì)菌病、病毒病和寄生蟲病的DNA 疫苗報(bào)道較多。但基于是否整合到宿主染色體等安全性考慮，核酸疫苗多處于實(shí)驗(yàn)研宄階段，尚未大量應(yīng)用。RNA 疫苗是近幾年才出現(xiàn)的一種核酸疫苗，主要在人類醫(yī)學(xué)中，作為RNA 類藥物，用于抗腫瘤研宄。在動(dòng)物疫苗領(lǐng)域尚未見RNA 疫苗的應(yīng)用報(bào)道。

5. 亞單位疫苗與合成肽疫苗。

利用物理化學(xué)方法提純病原微生物中具免疫原性的組份，或者利用基因工程表達(dá)該組分，純化后加入佐劑而制成。豬傳染性胸膜肺炎的亞單位疫苗中含有毒素I, 毒素II,毒素III 和外膜蛋白等， 能提供對(duì)所有15 個(gè)血清型的交叉保護(hù)力。我國使用的口蹄疫合成肽疫苗，是利用人工方法合成口蹄疫病毒VP1 蛋白中具有較強(qiáng)免疫原性的抗原片段，加入佐劑制成。該疫苗的優(yōu)點(diǎn)是抗原組分單一，純度高，免疫反應(yīng)強(qiáng)，副作用低；能迅速針對(duì)新出現(xiàn)變異毒株研制其合成肽疫苗。但是，其成本較高。

6．轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗。

將病原微生物中編碼免疫蛋白的基因插入植物基因組中，獲得表達(dá)病原微生物免疫原性的植物，再從植物中提純蛋白用于注射動(dòng)物或?qū)⒅参镏苯语曃箘?dòng)物，產(chǎn)生免疫力。用于表達(dá)免疫原性基因的植物主要是馬鈴薯、玉米、蔬菜、番茄、煙草和香蕉等，稱為轉(zhuǎn)基因可飼疫苗（ediable vaccine)。此類疫苗在口蹄疫（擬南芥、苜蓿和馬鈴薯為受體)、豬傳染性胃腸炎（馬鈴薯、花椰菜和土豆為受體)、腹瀉（煙草為受體）和輪狀病毒感染（番茄和馬鈴薯為受體）等疾病防控中有研究的報(bào)道,但未見臨床應(yīng)用。目前的技術(shù)難題是：選擇直接生食和貯藏方便的植物作為表達(dá)植株（煙草不適用于動(dòng)物基因的篩選和優(yōu)化其密碼子和使用合適啟動(dòng)子，使其表達(dá)量滿足疫苗免疫劑量的要求；免疫劑量免疫程序的確定；并設(shè)法提高口服后黏膜免疫效果。轉(zhuǎn)基因植物可飼疫苗主要應(yīng)用在胃腸道疾病中。

二、疫苗使用的注意事項(xiàng)

1． 建立在正確的流行病學(xué)調(diào)查基礎(chǔ)上，有針對(duì)性選擇所需疫苗，不可盲從。對(duì)于多血清型菌株感染，應(yīng)選擇與當(dāng)?shù)亓餍芯暄逍鸵恢碌囊呙纾庖咝Ч_實(shí)。

2．確保疫苗運(yùn)輸和使用過程中的冷鏈保障。如疫苗的物理性狀己經(jīng)改變，如分層現(xiàn)象，不可用手工混勻后再使用，應(yīng)丟棄。

3．細(xì)菌活疫苗使用前后不可同時(shí)使用抗生素或有抗菌活性的中草藥。

4．建議使用于健康豬群；正在發(fā)病豬群使用緊急接種，可能會(huì)加快處于疾病晚期豬只死亡，但是會(huì)縮短豬群的病程，因此要有心理準(zhǔn)備。

5．制定合理的免疫程序，避免母源抗體干擾。不同疫苗接種之間至少間隔1 周。不同疫苗的同時(shí)混合使用，要先做小范圍的觀察，如無副反應(yīng)，再大群使用。

第9篇

Bt毒蛋白基因是目前應(yīng)用得最為廣泛的抗蟲基因，主要特點(diǎn)是特異性強(qiáng)、殺蟲譜窄。Bt毒蛋白基因種類很多，其中CryI抗鱗翅目害蟲、CryII抗鱗翅目和雙翅目害蟲、CryIII抗鞘翅目害蟲、CryIV抗雙翅目害蟲。

外源凝集素可與昆蟲腸道上皮細(xì)胞的糖蛋白相結(jié)合，影響營養(yǎng)物質(zhì)的正常吸收，同時(shí)，還可促進(jìn)昆蟲消化道內(nèi)細(xì)菌的繁殖，對(duì)消化道造成損傷，從而達(dá)到殺蟲的目的。研究表明，轉(zhuǎn)外源凝集素基因水稻對(duì)稻飛虱有抗殺作用。

白葉枯病是水稻三大病害之一。迄今，國際上已鑒定出25個(gè)抗白葉枯病基因，其中由國際水稻研究所Khush從印度長雄蕊野生稻中發(fā)現(xiàn)的抗白葉枯病基因—Xa-21，對(duì)印度、菲律賓和中國的所有白葉枯病小種均表現(xiàn)高抗。國內(nèi)中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院章琦等也發(fā)現(xiàn)并定位了廣譜高抗白葉枯病基因Xa-23。1995年Song等克隆了Xa-21基因，研究表明，轉(zhuǎn)Xa-21基因水稻表現(xiàn)對(duì)白葉枯病的高度抗性和廣譜抗性。目前，我國雜交水稻大多數(shù)組合不抗白葉枯病，大力開展Xa-21抗白葉枯病基因工程育種具有重要意義。

稻瘟病是水稻三大病害之首。國內(nèi)外已發(fā)現(xiàn)30多個(gè)抗稻瘟病基因，其中Pi-b和Pi-ta已被克隆。國內(nèi)已有多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在進(jìn)行抗稻瘟病基因的分離克隆，預(yù)計(jì)不久將會(huì)有克隆的基因用于我國水稻抗稻瘟病基因工程育種。

除此之外，抗病基因的轉(zhuǎn)化研究已經(jīng)逐步向綜合性、多元性、廣譜性和間抗性的方向擴(kuò)展，即同時(shí)轉(zhuǎn)化多個(gè)抗性基因以獲得對(duì)多種病原菌的抗性，如將Bt、Cptl、Chi 基因相連接一起轉(zhuǎn)化受體作物品種，或者轉(zhuǎn)化具有水平抗性的基因以獲得對(duì)多種病源菌的廣譜抗性，例如，轉(zhuǎn)化RIPs 基因可以同時(shí)獲得抗病毒、抗真菌、抗蟲的轉(zhuǎn)化體材料。

水稻分子育種研究主要包括基因工程育種和分子標(biāo)記輔助選擇，利用這一技術(shù)在超高產(chǎn)育種中主要進(jìn)行以下研究：

株型改良：利用這一技術(shù)，進(jìn)行株型改良育種，如利用水稻分蘗控制基因MOCl，通過構(gòu)建載體將正義、反義MOCl基因轉(zhuǎn)入到一些當(dāng)家品種中，改良水稻株型，增加有效分蘗，形成理想株型的“分蘗梯度”。

提高水稻光合效率：為進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量潛力，科學(xué)家們正在試圖用現(xiàn)代植物基因工程技術(shù)，提高光合效率。其途徑主要包括調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉、提高Rubisco的效率和引入C4基因等。

調(diào)控延緩葉片衰老系統(tǒng)：細(xì)胞激動(dòng)素是一種重要的延緩葉片衰老的生長調(diào)節(jié)因子，其生物合成的第一步是異戊烯基側(cè)鏈轉(zhuǎn)移至5ˊ-AMP上。在農(nóng)桿菌中，這一反應(yīng)由tmr基因編碼的異戊烯基轉(zhuǎn)移酶所催化，并且這一反應(yīng)是細(xì)胞激動(dòng)素生物合成的限速步驟。Cao等通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法獲得了 PSAG12-IPT轉(zhuǎn)基因水稻植株，考察了自我調(diào)控延緩葉片衰老系統(tǒng)在水稻中的表現(xiàn)，結(jié)果表明具有早衰現(xiàn)象的水稻品種延緩葉片衰老后，能促進(jìn)灌漿，增加籽粒的充實(shí)度，從而提高結(jié)實(shí)率和千粒重，并最終增加單株產(chǎn)量。